核酸拷贝数定量数字PCR欢迎咨询

从上世纪90年代以来qPCR技术的爆发式发展使得现代核酸检测技术具有全新的面貌，而进入二十一世纪之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA测序技术正在迅速发展，也是目前竞争**为激烈的研究领域之一，即使在这种情况下，dPCR技术仍然以其高度的灵敏性和特异性在诸多科学领域争取到属于自己的一席之地。即使在一些传统的qPCR应用领域，也有一些实验室同时选择dPCR平台进行平行实验以保证实验结果的准确和可重复性。在基因组变异研究领域，群体基因组水平上的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）检测面临的问题主要是突变序列往往与大量正常序列同时存在，竞争性反应严重影响突变序列的检测精度，数字PCR技术带来的极高的扩增特异性在稀有突变检测方面具有天然的优势，在**标志物检测、无创产前检查、线粒体突变检测等研究方向上，我们已经看到dPCR的许多精彩表现。近年来，Bio-Rad、凯杰、赛默飞等巨头公司纷纷通过收购、投资等方式布局数字PCR业务。核酸拷贝数定量数字PCR欢迎咨询

传统 PCR 或定量 PCR 反应都是在96/384孔板中进行的，因此早期的数字PCR技术也采用 96 /384孔板作为反应单元。但是数字PCR技术的灵敏度取决于反应单元的总数n，因此，理论上反应单元数越多越有利于提高灵敏度和准确度，普通的96 /384孔板无法满足检测的需要。而且，在96 /384 孔板中进行的PCR反应体系通常大于5μl，由试剂消耗引起的高成本问题令人望而却步。针对上述问题， Morrison 等在25mm×75mm不锈钢芯片上刻蚀了3072个直径为300μm的微反应室(如图2a所示)，每个反应单元的体积降低至33 nl。该芯片可在商品化 PCR 仪上使用，与384 孔板的检测灵敏度相当，但反应体积降低为原来的1/64，样品通量提高了24倍。随着反应单元数目的成倍增加，反应体积从微升级降至纳升级，传统的操作人员采用移液器加试样的方式已经无法满足快速精细取样的要求，因此需要借助高通量自动点样仪或机械手等设备，这无疑大幅提高了系统的成本和操作的复杂性。四川高精确度数字PCR共同合作整个实验过程需严格按照标准流程进行实验操作。

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)提出至今已有20年时间，期间PCR已发展成为分子生物学领域的一项关键技术和常规技术，极大地推动了生命科学各个领域的发展。特别是90年代后期，美国ABI公司推出的实时荧光定量PCR(realtimePCR，qPCR)技术及相关产品更是将PCR由体外合成及定性/半定量检测技术发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的基因分析技术。尽管经过十几年时间的迅速发展，qPCR 技术已经用于除外伤和营养缺乏症外所有疾病的诊断，但是，在 PCR扩增过程中影响其扩增效率的因素有很多，不能保证在反应过程中扩增效率保持不变和实际样品与标准样品以及不同样品之间的扩增效率是相同的，由此导致其定量分析所依赖的基础——循环阈值(CT)不是恒定不变的。因此 qPCR 的定量只是“相对定量”，其准确度和重现性依然不能够满足分子生物学定量分析的要求。

CNV（Copy Number Variations，拷贝数变异）研究需要极高的定量精度以区别不同拷贝数之间的微小差异，测序方法适用于高于30%的变异率检测，而qPCR的比较**辨在1.5倍左右，数字PCR通过直接计数目标基因与参照基因( 拷贝数为1的基因，例如RNaseP) 的数目，计算比值，直接得到目标基因的拷贝数可以达到极高的拷贝数分辨精度。除此之外，dPCR在病原微生物检测、microRNA研究、基因表达研究、NGS测序文库的***定量、表观遗传学直接相关的DNA甲基化定量检测、ChIP定量鉴定等领域的应用都令人极为期待，而在转基因成分鉴定、分子标准品精确定量、环境样本检测等具体的应用方向上，已经有大量实验数据和结果证明了dPCR技术的优良性能。提高检测通量，可对多个靶标多个标本并行检测。

常规PCR和实时荧光PCR定量检测都需要已知拷贝数的标准DNA制定标准曲线，由于样品测定在各种条件上不会完全一致，会造成PCR扩增效率的差异，从而影响定量结果的准确性。而ddPCR不受标准曲线和扩增动力学影响，可以进行***定量。dPCR也有一些缺点，数字PCR系统成本高，通量有限、操作繁琐等不足。芯片式dPCR由于芯片加工成本高，系统复杂度高，使得商业化优势不是特别明显，特别是目前大多数分子诊断qPCR也能够很好的满足需求，dPCR增加的收益成本比并不算高。液滴式相对芯片式成本有所下降，但典型的液滴式dPCR液滴形成和PCR扩增和检测都分别在不同仪器中完成，增加了很多操作，也增加了系统的复杂性，从这点上看全自动荧光定量PCR做的更好。不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线。核酸拷贝数定量数字PCR欢迎咨询

整个实验流程可在2小时内完成。核酸拷贝数定量数字PCR欢迎咨询

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的***定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时*判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响**降低，对PCR反应抑制物的耐受能力**提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。核酸拷贝数定量数字PCR欢迎咨询