湖北核酸拷贝数定量数字PCR服务

肺*的EGFR突变检测：EGFR突变目前已成为非小细胞肺*（Non-Small-Cell Lung Cancer，NSCLC）患者常规的伴随诊断，对于EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的使用具有重要的指导作用。然而，由于多数NSCLC都处于晚期，很难取到足够的**组织完成该检测，不方便对患者的疗效和耐药情况进行动态监测。相反，血液、胸水以及脑脊液之类的体液标本中会含有**来源的DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA），它们更容易获取，被认为是组织标本的有效替代品。由于体液标本中ctDNA的含量非常低，因此对检测方法提出了很高的要求。近年来，有研究者证实，数字PCR的检测敏感性可以低至0.04%，EGFR突变的血浆检测与组织学检测能够有很好的吻合性，相比于传统的检测方法，数字PCR可以***提高血浆中EGFR突变的检出率。此外，利用数字PCR***定量的优势，可以对血浆中EGFR突变的丰度进行动态监测，这种动态变化与患者使用TKI的疗效密切相关，可以更好的指导患者的***。随着越来越多循证医学证据的出现，NSCLC的血液EGFR突变检测正在成为ddPCR相当有前景的应用方向。目前有超过130万条经锁核酸修饰的引物，提供至少3种设计方案以满足不同跨外显子区域的检测需求。湖北核酸拷贝数定量数字PCR服务

传统 PCR 或定量 PCR 反应都是在96/384孔板中进行的，因此早期的数字PCR技术也采用 96 /384孔板作为反应单元。但是数字PCR技术的灵敏度取决于反应单元的总数n，因此，理论上反应单元数越多越有利于提高灵敏度和准确度，普通的96 /384孔板无法满足检测的需要。而且，在96 /384 孔板中进行的PCR反应体系通常大于5μl，由试剂消耗引起的高成本问题令人望而却步。针对上述问题， Morrison 等在25mm×75mm不锈钢芯片上刻蚀了3072个直径为300μm的微反应室(如图2a所示)，每个反应单元的体积降低至33 nl。该芯片可在商品化 PCR 仪上使用，与384 孔板的检测灵敏度相当，但反应体积降低为原来的1/64，样品通量提高了24倍。随着反应单元数目的成倍增加，反应体积从微升级降至纳升级，传统的操作人员采用移液器加试样的方式已经无法满足快速精细取样的要求，因此需要借助高通量自动点样仪或机械手等设备，这无疑大幅提高了系统的成本和操作的复杂性。荧光信号数字PCR专业服务可以用于白血病融合基因检测。

数字PCR即Digital PCR（dPCR)，是一种核酸分子***定量技术。数字PCR是一种基于单分子快速PCR扩增，进行核酸拷贝数定量的一种方法。数字PCR( 也可称单分子PCR) 一般包括两部分内容，即PCR 扩增和荧光信号分析。在PCR 扩增阶段，与传统技术不同，数字PCR 一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应。不同于qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。***通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。

为确保实验顺利进行，QIAcuity EG PCR Kit和Probe PCR Kit均采用**抗体修饰的热启动DNA聚合酶，利用小分子锁扣 (Guard molecular) 将DNA聚合酶与抗体紧密结合形成双保险，使其室温条件下失活，只有通过95℃高温2分钟才能开启小分子锁扣，***DNA聚合酶活性，有效避免了非特异性扩增现象。微反应单元体积大小一致且稳定是泊松分布准确计算的前提。样本反应液在进行液滴分散过程中由于液体表面张力、操作不当等影响，导致其部分发生融合和破裂。融合使液滴体积变大，破裂则导致有效分区数量变少更增加了交叉污染的风险。因此，整个实验过程需严格按照标准流程进行实验操作。相较于液滴式分区，QIAcuity数字PCR搭配的Nanoplate采用**纳米微孔设计，利用微流体技术将数字PCR反应体系分配到大小均一且固定微孔中，并在分区完成后自动封闭所有微孔联通管道，真正意义上实现**均一的微反应体系。提取外泌体也是个非常费时费钱的事情。

数字PCR作为新一代PCR技术，采用芯片载体将PCR反应体系分配到20000个微孔中，实现单分子模板的扩增，通过荧光信号的有无来判断每个微孔的阴阳性**终利用泊松分布校正结果给出***定量值（copy/ul），利于精细定量样品中的拷贝数，且灵敏度高（0.1%），即使针对血液中低频的ctDNA检测也同样适用。数字PCR技术在血液cfDNA低突变丰度检出中的出色表现，以及涵盖多种变异形式（SNV、InDel、融合和扩增）的检测能力，均证明其作为液体活检领域的重要“神技”，可广泛应用于医疗机构、临检中心和科研院所等。数字PCR可以用来研究基因表达。数字PCR数字PCR怎么样

对干扰分子（背景信号、PCR抑制剂等）耐受度高，通过信号的“有”“无”定量而不是Ct值。湖北核酸拷贝数定量数字PCR服务

CNV（Copy Number Variations，拷贝数变异）研究需要极高的定量精度以区别不同拷贝数之间的微小差异，测序方法适用于高于30%的变异率检测，而qPCR的比较**辨在1.5倍左右，数字PCR通过直接计数目标基因与参照基因( 拷贝数为1的基因，例如RNaseP) 的数目，计算比值，直接得到目标基因的拷贝数可以达到极高的拷贝数分辨精度。除此之外，dPCR在病原微生物检测、microRNA研究、基因表达研究、NGS测序文库的***定量、表观遗传学直接相关的DNA甲基化定量检测、ChIP定量鉴定等领域的应用都令人极为期待，而在转基因成分鉴定、分子标准品精确定量、环境样本检测等具体的应用方向上，已经有大量实验数据和结果证明了dPCR技术的优良性能。湖北核酸拷贝数定量数字PCR服务