江苏重现性数字PCR方案

数字PCR技术的原理非常简单，然而在样品分散（divide）的环节上却遇到了无法突破的瓶颈。早期的dPCR尝试使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作为分散反应的载体，或者采用类似流式技术的磁珠乳液扩增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了***台商品化的基于芯片的商品化数字PCR系统。2008年德国 Inostics 推出基于磁珠法乳浊液扩增和流式检测方式的BEAMing dPCR 检测服务，但这些方法无论在分散程度和数据群体的体量上都无法达到更加精细的要求，时间和耗材成本严重限制了dPCR技术的发展。数字PCR技术为基因表达分析提供了高精确的定量分析方法。江苏重现性数字PCR方案

CNV（Copy Number Variations，拷贝数变异）研究需要极高的定量精度以区别不同拷贝数之间的微小差异，测序方法适用于高于30%的变异率检测，而qPCR的比较**辨在1.5倍左右，数字PCR通过直接计数目标基因与参照基因( 拷贝数为1的基因，例如RNaseP) 的数目，计算比值，直接得到目标基因的拷贝数可以达到极高的拷贝数分辨精度。除此之外，dPCR在病原微生物检测、microRNA研究、基因表达研究、NGS测序文库的***定量、表观遗传学直接相关的DNA甲基化定量检测、ChIP定量鉴定等领域的应用都令人极为期待，而在转基因成分鉴定、分子标准品精确定量、环境样本检测等具体的应用方向上，已经有大量实验数据和结果证明了dPCR技术的优良性能。浙江重现性数字PCR经验丰富提高检测速度，进一步降低检测时间。

乳腺*的分型：ER，PR和HER2是乳腺***常用的分子标志物，在患者在开始***之前必须要明确这几个分子标志物的具体状态。传统的检测方法是通过IHC来确定蛋白的表达情况，而HER2检测也还可以通过FISH来判断染色体的扩增情况。尽管相应的检测都有明确的指南来加以规范，但是在临床实践过程之中，有些检测结果不可避免的还是会受到人为操作和判读的主观影响，从而导致同一样本的结果偏差，为临床的治疗带来了极大的困惑。有研究者尝试采用四重数字PCR方法，对这几个标志物同时进行定量检测。95例石蜡标本的对比分析结果显示，HER2，ER和PR与IHC的一致性分别为96.8%，91.5%和85.1%，而ROC曲线下面积则分别为0.991，0.977和0.920，说明该方法与IHC方法有较好的一致性。此外，相比于IHC方法，数字PCR方法还具有操作和判读标准化、结果重复性好、检测周期短、标本使用量少等优势，未来在临床将会有很好的应用前景。

与传统qPCR技术相比，数字PCR技术具有极高的灵敏度、特异性和精确性，但截止目前而言，数字PCR对广大科研工作者仍然是一种全新的检测方法，我们在看待数字PCR的应用前景时，更应该保持一种开放的心态，与其说数字PCR技术是一个新的检测平台，不如把它视为一种全新的技术思路和手段，在这个平台上必将有更多的应用帮助我们深入到分子生物学研究的更高层次。数字PCR被称为第三代PCR技术，相比于传统的PCR技术和荧光定量PCR技术，其具有诸多优势：（1）***定量，不依赖标准品和参考曲线，定量结果更加准确可靠；（2）高灵敏度，可实现单分子级检测；（3）高分辨率，适合在大量背景模板的干扰下对罕见的目标分子进行检测；（4）高稳定性，对抑制剂的耐受程度**增强。凭借这些优势，数字PCR被广泛应用于多个不同的领域[4]，特别是生物医学领域，包括稀有突变检测、基因拷贝数变异检测、基因表达研究、甲基化水平检测、**液体活检、无创产前检测、微生物（病毒、细菌等）检测、移植排斥监控和二代测序辅助建库等。此外，此技术也被用于农业、食品安全和环境科学等诸多领域。开发多靶点检测的多重数字PCR检测，可以通过多种荧光染料或标记技术来实现。

数字PCR的技术优势在SARS-CoV-2的核酸检测中得到了完整的体现，在低拷贝病毒样本检测、不同临床样本类型病毒载量定量、样本制备方法评估、病情进展动态监测、参考品制备、环境中病毒浓度监测、病毒突变检测和抗病毒药物评价多个方面均有重要作用：（1）在低拷贝病毒样本检测中，数字PCR相比COVID-19诊断金标准逆转录荧光定量PCR（RT-qPCR）具有更低的检测限和更高的灵敏度。（2）针对不同类型的COVID-19临床样本（如鼻咽拭子、痰液、血液、尿液、粪便、支气管肺泡灌洗液等），使用数字PCR能够有效评估各个类型样本的病毒载量，尽可能选择病毒载量**多的样本以提高检出率。（3）在样本制备方法评估中，利用数字PCR定量不同灭活方法处理前后样本中的病毒量，能够明确处理方法对样本的影响，从而为临床实验室提示比较好样本制备方法。（4）研究人员利用数字PCR定量患者不同时期的样本中的病毒载量，发现在早期和进展期的病毒载量明显高于恢复期的病毒载量，提示动态监测样本中的病毒载量有助于评估疾病的进展。不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线。上海荧光信号数字PCR售后分析

线粒体拷贝数分析与线粒体突变分析。江苏重现性数字PCR方案

甲基化分析：DNA甲基化是哺乳动物DNA的一种常见表观遗传修饰，它通过调节细胞中的基因表达从而在发育和疾病过程中发挥了重要的作用。异常的DNA甲基化涉及整个基因组的整体低甲基化和位于基因启动子区域和基因间DNA的CpG岛的局部超甲基化，这是人类恶性**中一个常见的表观遗传改变。基于PCR的方法已经被***的应用于DNA甲基化的评估，其原理是先采用亚硫酸氢盐来处理DNA，这会通过脱氨基作用将未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，然后设计与这些DNA进行特异结合的引物和探针进行扩增检测。然而，传统的PCR检测容易受到PCR抑制剂的影响，在非甲基化等位基因的背景下进行稀有甲基化等位基因检测的敏感性有限。而数字PCR是在无数个**的分隔之中进行反应，因此彼此之间较少受到抑制剂的影响，能够对传统方法检测不到的罕见甲基化等位基因进行精细的检测，未来有望将DNA甲基化作为一个具有区域性*变的预测指标或者**风险生物标志物来使用。江苏重现性数字PCR方案