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PCR实验技术中的反向PCR介绍:反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA,也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA.反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列,因此又称为染色体步移。这时选择的引物虽然与中心DNA两末端序列互补,但引物3’端是相互反向的。反向PCR的操作流程:扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA,然后用DNA连接酶连接成一个环状分子,通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。选择多种限制性内切酶,基本准则是选择不能在非酶切位点切断靶DNA的酶。裂解中心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或下游区,而不裂解中心区的酶则使两侧序列都扩增Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列,所以往往需要两组到三组嵌套引物做pcr,样本该如何保存?贵州组织pcr多少钱

pcr是一种在体外扩增特定DNA序列的技术方法,通过与特定DNA区域两端互补的寡核苷酸为引物(primer)在试管中DNA聚合酶选择性地单独复制合成介于两引物直接的基因片段,如同DNA复制中的半保留复制一样,新合成的基因片段与模板链形成新的DNA双链,经反复的变性(denature)引物退火(anerling)和引物延伸(extention)三步循环,前一循环合成的DNA链成为下一循环引物结合的模板,每循环一次,反应体系的DNA的量就增加一倍,20-30次反复循环,即可由微量的DNA模板开始获得大量的DNA特异片段。近年来,PCR迅速发展,已深入生命科学的各个领域,技术方法不端完善,基本的PCR实验技术主要有经典PCR技术、RT-PCR技术、免疫-PCR技术、PCR-SSCP技术等。辽宁组织pcr实验pcr检测实验多久出结果?

PCR实验技术中的免疫-PCR(immuno-PCR)介绍:免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统。它利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原,尤其适用于极微量抗原的检测。免疫-PCR试验的主要步骤有三个:①抗原-抗体反应,②与嵌合连接分子结合,③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒DNA)。该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备。在免疫-PCR中,嵌合连接分子起着桥梁作用,它有两个结合位点,一个与抗原抗体复合物中的抗体结合,一个与质粒DNA结合,其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似,不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA,在操作反应中形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物,通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原。免疫PCR优点为:①特异性较强,因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上。②敏感度高,PCR具有惊人的扩增能力,免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上,可用于单个抗原的检测。③操作简便,PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多,一般实验室均能进行。
PCR的假阳性主要原因之一出现非特异性扩增带:PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。PCR的假阳性主要原因之一出现片状拖带或涂抹带:PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量,减少循环次数。pcr检测实验有哪些分类?

PCR实验技术中的3’RACE-PCR介绍:利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准1号链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1(genespecificprimer,GSP)作为上游引物,用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universalprimer,UPM)作为下游引物,以cDNA1号链为模板,进行PCR循环,把目的基因3‘末端的。DNA的片段扩增出来。
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PCR实验技术中的高GC含量PCR(GC-richPCR)介绍:具有高GC含量(>65%)的模板由于G和C碱基间的强氢键影响,比较难以扩增。高GC含量序列同时也涉及二级结构。因此,高GC含量序列可使DNA聚合酶在扩增时卡住,从而影响了DNA的合成。为了扩增高GC含量片段,双链模板必须分离,以便引物结合及DNA聚合酶读取序列。为了克服强GC相互作用,较常用的方法是依靠PCR添加剂或共溶剂来帮助DNA变性(图6A),如DMSO。这些试剂通常会降低引物的Tm,所以退火温度也需做相应的调整。高合成能力的DNA聚合酶由于其与模板的强结合能力,有助于高GC含量模板的PCR扩增(图6B)。高热稳定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR扩增,因为更高的变性温度(如98℃代替95℃)可促进解链和PCR扩增。贵州组织pcr多少钱
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