CD42b免疫

荧光色素：四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：较大吸引光波长为550nm，较大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展较早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光技术可以用于研究环境污染和毒物作用。CD42b免疫

荧光标记二抗的选择普遍；与使用荧光素结合一抗的检测相比，成本较低。间接免疫荧光的缺点：由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体，因此物种交叉反应性问题增加；与直接免疫荧光相比，时间更长（操作步骤更多）。间接免疫荧光的优点：通过增加能够与一抗结合的二抗数量进行信号放大；与直接免疫荧光相比，通过信号放大提高检测灵敏度；荧光标记二抗的选择普遍；与使用荧光素结合一抗的检测相比，成本较低。间接免疫荧光的缺点：由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体，因此物种交叉反应性问题增加；与直接免疫荧光相比，时间更长（操作步骤更多）。CTNT免疫荧光检查使用已知荧光抗原标记物质来检查相应抗体的方法被称为荧光抗原技术。

细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1. 取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。6. 二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。7. 较好用DAPI染核，然后直接照荧光片。8. 蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

细胞的固定及免疫荧光：注意事项：（1）取细胞爬片时，动作应轻柔，防止将细胞爬片夹碎，影响实验进程。（2）种细胞过程中，要注意将细胞轻柔混匀，“八”字或者“十”字形摇晃，防止细胞局部生长过密。（3）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光。（4）细胞爬片进行免疫荧光之后，需要尽快拍照，防止免疫荧光淬灭。或者放于暗盒内，暂时保存于4度冰箱，尽快拍照。（5）在进行荧光显微镜拍照时，要根据荧光抗体选择合适的激发光源。PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。免疫荧光技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域具有普遍应用。

细胞免疫荧光实验注意事项：非特异性染色：是否灭活内源性过氧化物酶；孵育过程中干片；抗原热修复过度。染色过深：一抗浓度过高；染色试浓度过高或孵育时间过长；染色剂浓度过高或孵育时间过长。通常实验室先固定细胞再进行通透，但若检测抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，这样可以通过通透去除一些水溶性蛋白，进而可降低免疫荧光背景和非特异性信号；建议设阴性对照组，消除由于抗体非特异性结合而产生的背景染色；选择醛类固定液时，保持其新鲜度，较好现配现用，使用不新鲜的醛类固定液自发荧光背景会升高。免疫荧光是一种常用的生物学实验技术，用于检测和定位特定抗原或抗体。CD42b免疫

免疫荧光技术可以用于研究遗传疾病和基因表达调控。CD42b免疫

免疫荧光通透（目的是使抗体进入胞内），0.5%TritonX-100(一种去垢剂，用PBS配制)室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了TritonX-100，也可作为通透剂，并且固定后的样品不需要通透。封闭（减少一抗和二抗与非特异位点进行结合），通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。CD42b免疫

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