徐州分子生物学荧光定量PCR技术服务

Real-timePCR的反应条件：dNTP浓度过高会加快反应速度，但同时还可以增加碱基的错误掺入率。引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增。TaqDNA聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增，低则合成产物量减少。TaqDNA聚合酶无校正功能，掺入错误率达2*E-4个核苷酸，一个30个循环的扩增反应0.1%-0.25%总错误率。在90～95度下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94～95度30～60s。时间过长使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破坏增多。DNA很快冷却到40～60度使引物和模板结合。引物长度在15～25时退火温度。PCR可能是分子生物学中使用很较广的技术。徐州分子生物学荧光定量PCR技术服务

Real-time PCR-传统定量PCR：扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，之后酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。无锡微量PCR检测技术应用Real-time PCR探针法普遍用于人类传染病的诊断和病原定量。

Real-time PCR实验注意事项-防止RNA酶污染的措施：1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专业使用实验室，所有器械等应为专业使用。

聚合酶链式反应的试验污染：阳性对照，在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定。聚合酶链反应为这些技术提供了大量的纯DNA，有时是单链的。

Real-time PCR原理：基于探针的化学法，Real-time PCR应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物；依赖荧光能量共振传递（FRET）检测特异性扩增产物，单单检测特异性扩增产物，DNA及RNA定量；基因表达验证；等位基因鉴别；SNP分型；病原体和病毒检测；多重PCR，探针和目标片段的特异性结合产生荧光信号，因此减少了背景荧光和假阳性；探针可标记不同波长的荧光基团，用于多重PCR反应。对于不同的靶序列需要合成不同的探针，原料成本较高。Real-time PCR在实验过程中注意避免mRNA的断裂。杭州分子生物学PCR检测技术哪家好

实时荧光定量PCR的定量方法，在Real-time PCR中，模板定量有两种策略。徐州分子生物学荧光定量PCR技术服务

Real-time PCR链反应的常见问题分析与解决方法：反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。引物量过多。减少反应体系中引物的用量。模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。外源DNA污染。确保操作的洁净。阴性对照出现条带：试剂，头，工作台污染。使用全新的试剂和头，对工作台进行清洁。条带大小与理论不符：污染。使用全新的试剂和头，对工作台进行清洁。模板或引物使用错误。更换引物和模板。基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。逆转录-聚合酶链反应较广用于表达谱，以确定基因的表达或鉴定RNA转录物的序列。徐州分子生物学荧光定量PCR技术服务

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