连云港细胞数字PCR研究方案
Real-time PCR原理:基于探针的化学法,Real-time PCR应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物;依赖荧光能量共振传递(FRET)检测特异性扩增产物,单单检测特异性扩增产物,DNA及RNA定量;基因表达验证;等位基因鉴别;SNP分型;病原体和病毒检测;多重PCR,探针和目标片段的特异性结合产生荧光信号,因此减少了背景荧光和假阳性;探针可标记不同波长的荧光基团,用于多重PCR反应。对于不同的靶序列需要合成不同的探针,原料成本较高。PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内,有些很好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失。连云港细胞数字PCR研究方案

Real-time PCR:1.DNA或RNA的定量分析:Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测,RNAi基因失活率的检测等;2.基因表达差异分析:例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等),特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA晶片或差显结果的确证;3.基因分型:例如SNP检测,甲基化检测等。Real-time PCR常用的两种方法分别为Sybrgreen(萤光染料掺入法)和Taqmanprobe(探针法)。连云港骨头定量PCR应用实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。

聚合酶链式反应的试验污染:PCR反应的很大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人脑袋不适的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因:标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。如果基因的基因组DNA序列是已知的,逆转录-聚合酶链反应可以用来绘制基因中外显子和内含子的位置。
Real-time PCR探针法适用于:1、具有高适应性和可靠性,实验结果稳定重複性好,特异性更高。2、适用于扩增序列专一的体系的检测。3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。4、靶基因的特异序列较短,无论怎样较佳化引物设计条件都不能解决。5、存在与靶基因同源的序列,在PCR中容易出现非特异性扩增,对特异性要求较高的定量。6、普遍用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物製品的鉴定。Real-time PCR探针法:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的萤光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告萤光基团和一个淬灭萤光基团。探针完整时,报告基团发射的萤光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告萤光基团和淬灭萤光基团分离,从而萤光监测系统可接收到萤光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个萤光分子形成,实现了萤光信号的累积与PCR产物形成完全同步。聚合酶链反应的这种能力增强了许多方法,例如生成杂交探针用于杂交。

Real-time PCR从用途上分可以分为定性分析和定量分析:定性分析指的是用于分析待检测的样本中是否存在我们想要检测的成分,即待检测成分有无的分析。通常,定性分析可以应用于病毒以及病原菌的检测,物种鉴定以及基因分型等。病毒及病原菌检测,如SARS、H1N1病毒,都可以通过Real-time PCR的方法进行高灵敏度的检测,定性分析样本是否已被病毒传播。物种鉴定如我们国家的一些检验检疫机构,想要检测进口的牛肉制品中是否含有鸡源、猪源或鸭源等成分,或者用于检测羊奶中是否会掺有牛奶等等,可以通过Real-time PCR的方法进行检测。基因分型,如啤酒型,肥胖型基因的检测,就是Real-time PCR在基因分型方面的应用。PCR的很大特点是能将微量的DNA大幅增加。宁波组织数字PCR原理
嵌套式PCR在特异性扩增长DN段方面通常比传统PCR更成功,但它需要更详细的目标序列知识。连云港细胞数字PCR研究方案
Real-time PCR:所谓Real-time PCR技术,是指在PCR反应体系中加入萤光基团,利用萤光信号累积实时监测整个PCR进程,之后通过标準曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用萤光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标準曲线的分析对起始模板进行定量分析。Real-time PCR技术即实时萤光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差,提高实验的重複性。该技术已经被普遍用于监测细胞mRNA表达量的变化;比较不同组织的mRNA表达差异;验证基因晶片,siRNA干扰的实验结果。连云港细胞数字PCR研究方案
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