深圳实时PCR检测技术原理及步骤

时间:2022年03月10日 来源:

聚合酶链反应:在检测病原体方面,病原体培养是临床诊断的金标准 .但是对于一些苛养菌 生长缓慢的细菌或难以培养的病原体等培养的阳性检出率不高.检测时间过长 无法满足临床早期快速诊断以指导医治的需要[3]。当前 PCR 技术是在传统 PCR 技术应用的基础上进行的改进,包括实时定量 PCR 技术 、 实时荧光定量PCR、 PCR-酶联免疫吸附试验 、 巢式PCR等。 在PCR技术的辅助作用下,实验室检测也逐渐从生化免疫诊断过渡到基因诊断,生化免疫检测主要从表型表现评估病症,而基因诊断则深入本质探究其病因,以PCR 技术为主的核酸技术在临床实验室检测与疾病诊断中表现出了明显的应用价值,在未来的临床医学检验中必将会得到更加较广的应用。聚合酶链反应非常敏感,有可能产生数百万到数十亿份特定产品的拷贝,用于测序、克隆和分析。深圳实时PCR检测技术原理及步骤

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聚合酶链式反应PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;引物的延伸:DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。南通细胞荧光PCR研究方案热启动聚合酶链式反应:一种在PCR的初始建立阶段减少非特异性扩增的技术。

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聚合酶链反应有许多优点。它很容易理解和使用,并迅速产生结果。这项技术非常敏感,有可能产生数百万到数十亿份特定产品的拷贝,用于测序、克隆和分析。qRT-PCR具有与PCR相同的优点,同时还具有定量合成产物的优点。因此,它可以用于分析病症、微生物或其他疾病状态中基因表达水平的变化。聚合酶链反应是一种非常强大和实用的研究工具。许多疾病的未知病因的测序正在通过聚合酶链反应得到解决。这项技术可以帮助我们识别与已知病毒相关的未知病毒序列,从而让我们更好地了解疾病本身。如果该过程可以进一步简化,并且可以开发灵敏的非辐射检测系统,PCR将在未来几年在临床实验室中占据明显地位。

聚合酶链反应:嵌套聚合酶链反应:通过减少DNA非特异性扩增的背景,提高DNA扩增的特异性。两组引物用于两个连续的PCR。在个反应中,一对引物用于产生DNA产物,除了预期的靶之外,该产物可能仍然由非特异性扩增的DN段组成。然后用一组引物将产物用于第二次聚合酶链反应,所述引物的结合位点完全或部分不同于次反应中使用的每个引物,并且位于其中的3’。嵌套式PCR在特异性扩增长DN段方面通常比传统PCR更成功,但它需要更详细的目标序列知识。重叠延伸聚合酶链反应或者通过重叠延伸拼接(SOEing):一种用于将两个或多个含有互补序列的DN段拼接在一起的基因工程技术。它用于连接含有基因、调节序列或突变的DN段;这项技术可以创造特定的长DNA构建体。它还可以将缺失、插入或点突变引入DNA序列。流聚合酶链反应:一种伪等温PCR方法。

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聚合酶链式反应的试验污染:PCR反应的很大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人脑袋不适的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 污染原因:标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。多重连接依赖探针扩增允许用单个引物对扩增多个靶标,从而避免多重PCR的分辨率限制。深圳实时PCR检测技术原理及步骤

聚合酶链式反应可看作是生物体外的特殊DNA复制。深圳实时PCR检测技术原理及步骤

聚合酶链反应也可以用作以下敏感试验的一部分组织分型,对移植至关重要。截至2008年,甚至有人提议用聚合酶链反应检测取代传统的血型抗体检测。许多形式的病症涉及致病基因的改变。通过使用基于聚合酶链反应的测试来研究这些突变,医治方案有时可以根据患者的不同而不同。聚合酶链反应可以早期诊断恶性疾病,如白血病和淋巴瘤,这是目前病症研究中发展很快的,并且已经被常规使用。PCR检测可以直接在基因组DNA样品上进行,以检测易位特异性恶性细胞,其灵敏度至少是其他方法的10,000倍。聚合酶链反应在医学领域非常有用,因为它允许分离和扩增病症抑制剂。例如,定量PCR可以用于量化和分析单细胞,以及识别DNA、mRNA和蛋白质的确认和组合。深圳实时PCR检测技术原理及步骤

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