广州医学电生理膜片钳原理及步骤

膜片钳实验常见问题及解决方法：膜片钳技术是电生理记录的常用手段，目前在科学研究中使用越来越普遍。但在具体膜片钳实验操作的过程中，总会遇到各种各样的问题，对实验人员造成很多困扰。本次讲座主要从实验角度出发，以简单，实用的原则，着重讲解实验中遇到的各种问题，以及解决方法。从选择实验样本开始，按照一般实验进行的顺序，逐步延伸，一直到如何搭建自己个性化的膜片钳系统，使大家对膜片钳的基础知识以及膜片钳实验中遇到的各种典型问题及解决办法有系统的了解。膜片钳使用操作流程及注意事项：凡是在本平台使用仪器的同学必须履行实验室相关要求。广州医学电生理膜片钳原理及步骤

膜片钳使用的注意事项：工作原理膜片钳是一种能够直接观察单一的离子通道蛋白质分子对相应离子通透难易程度等特性的一种实验技术。它的基本原理是以一个光洁，直径约为0.5~3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触，之后对微电极另一端开口处施加适当的负压用电极的纤细开口将与电极接触的那一小片膜轻度吸入，如此在微电极开口处的玻璃边沿以及这一小片膜周边会形成紧密的封接，它的电阻能够达到数个或数十个千兆欧，这世界上就是在化学上完全隔离了吸附在微电极开口处的那一片膜同膜的其余部分，通过微电极记录到的电流变化光光和该膜片中通道分子的功能状态相关联。膜片钳技术用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面，使之形成10~100MΩ的高阻封接，被孤立的小膜片面积为微米数量级，因此封接范围内细胞膜光有少数离子通道。福州医学膜片钳电生理技术服务膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。

膜片钳使用的基本方法是，把经过加热抛光的玻璃微电极在液压推进器的操纵下，与清洁处理过的细胞膜形成高阻抗封接，导致电极内膜片与电极外的膜在电学上和化学上隔离起来，由于电性能隔离与微电极的相对低电阻（1～5MΩ），只要对微电极施以电压就能对膜片进行钳制，从微电极引出的微小离子电流通过高分辨、低噪声、高保真的电流-电压转换放大器输送至电子计算机进行分析处理。膜片钳技术实现的关键是建立高阻抗封接，并能通过特定的记录仪器反映这些变化，因而，膜片钳实验室除了一般电生理实验所需的仪器外，还特需防震工作台、屏蔽罩、膜片钳放大器、三维液压操纵器、倒置显微镜、数据采集卡、数据记录和分析系统等。

膜片钳技术：膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极与细胞膜的高阻封接，在电极笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就替代单一离子通道电流。膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起，同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起，改变了既往各个分野互不联系、互不渗透，阻碍人们很全认识能力的弊端。膜片钳使用操作流程及注意事项：在仪器使用以前及使用之后按按照使用时长做好登记工作。

膜片钳记录的几种形式：内面向外膜片(inside-out patch)　高阻封接形成后，在将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中就得到“内面向外”膜片。此时膜片两侧的膜电位由固定电位和电压脉冲控制。浴槽电位是地电位，膜电位等于玻管电位的负值。如放大器的电流监视器输出是非反向的，则输出将与膜电流(Im)的负值相等。外面向外膜片(out-side patch)　高阻封接形成后，继续以负压抽吸，膜片破裂再将玻管慢慢地从细胞表面垂直地提起，断端游离部分自行融合成脂质双层，此时高阻封接仍然存在。而膜外侧面接触浴槽液。膜片钳的数据如何处理：电极管内与细胞之间弥散交换与平衡快,因而容易控制细胞内液的成分。福州医学膜片钳电生理技术服务

膜片钳技术是在电压钳技术发展起来的，电压钳是利用负反馈技术将膜电位在空间和时间上固定于某一测定值。广州医学电生理膜片钳原理及步骤

膜片钳技术在通道研究中的重要作用：1.与药物作用有关的心肌离子通道：心肌细胞通过各种离子通道对膜电位和动作电位稳态的维持而保持正常的功能。近年来，国外学者在人类心肌细胞离子通道特性的研究中取得了许多进展，使得心肌药理学实验由动物细胞模型向人心肌细胞成为可能。2.对离子通道生理与病理情况下作用机制的研究：通过对各种生理或病理情况下细胞膜某种离子通道特性的研究，了解该离子的生理意义及其在疾病过程中的作用机制。广州医学电生理膜片钳原理及步骤