hMeDIP-Seq技术服务方案

    将待测DNA经过亚硫酸盐处理，通过PCR扩增过程引入T7启动子序列，经T7DNA聚合酶的体外转录过程得到各样本RNA产物，经碱基特异性酶切处理，得到RNA小片段，并用飞行质谱检测每个片段的分子量，***EpiTYPER程序完成数据的自动化处理并报告每个检测片段的甲基化程度。技术优势·检测片段长：扩增片段长度可达500bp·高灵敏度：可发现低至5%甲基化水平，样本起始量低至10ng。·重复性好：变异系数CV≤5%。·高性价比：用384孔板进行PCR反应，一个扩增产物可以进行多重CpG位点分析，无需后续验证，可直接用于文章发表。服务内容1.根据客户提供的序列信息进行预评估；2.进行样本DNA的分离、纯化、质检及亚硫酸盐修饰。3.使用特殊设计的一对引物扩增样本，得到带有T7RNA聚合酶启动子序列的扩增产物。4.在体外转录体系中，利用T7RNA聚合酶，将扩增产物转录为RN**断。5.利用RNaseA能够特异性识别并切割RNA中U3’端的特性，将RN**断切割成携带有CpG位点的小片断。6.使用sequenom®MassArray飞行质谱分析系统检测产物。由于同一片断中，只有CpG和CpA之间16Da的分子量差别，即质谱图中两者峰的差距。 cfDNA，cell free DNA，就是血液中游离的自身DNA。hMeDIP-Seq技术服务方案

    虽然焦磷酸测序可以进行单个位点甲基化程度的精确定量，但是目前来看，测序的片段长度还比较短，只有一百多bp，其中有效长度约为60bp。以上是对几种常用的特异位点甲基化检测方法进行了介绍及比较，还有一些检测技术是在常用的检测手段上进行优化或者将不同的方法进行结合应用，比如以MSP方法为基础，发展了SMART-MSP技术，该技术利用定量技术对MSP扩增过程进行检测，同时后续结合HRM技术来分析甲基化差异。此外，利用质谱平台进行甲基化检测的有MALDI-TOF技术，可以对甲基化进行精确检测并能进行高通量筛选。从对这些技术的比较分析来看，没中检测技术都有各自的优点，并也存在一定的局限性，研究者可以根据自己的实际研究情况进行选择。在特异甲基化位点检测上，能够提供BSP、HRM及焦磷酸测序三种技术的完整的检测服务，具有丰富的经验，帮助客户加速甲基化研究进程。 北京焦磷酸测序技术服务怎么样5mc是表观遗传重要的一种修饰，存在于植物、动物等真核生物基因组中，被誉为“第五碱基”。

甲基化特异性PCR（MS-PCR）

DNA在亚硫酸氢盐作用后，DNA CpG若无甲基化，则序列中的C改变为U，若有甲基化则保持不变，因此从理论上讲，用不同的引物做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。因此根据目的基因修饰前后的改变，就可以相应设计M和U引物，有时我们需要设计两轮引物。

这种方法灵敏度高，无需特殊仪器，因此经济实用，是目前应用**为***的检测方法。不过也存在一定的局限性，预先需要知道待测片段的DNA序列，引物的设计非常重要。另外，亚硫酸氢盐处理也十分关键，若处理不完全则可能导致假阳性的出现。

    甲基化是表观修饰的重要部分，DNA甲基化可以引起DNA构象、稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而影响基因表达。DNA链中含有很多CpG结构，双链DNACpG中的胞嘧啶五位碳原子通常容易被甲基化，基因组中60~90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇出现在基因启动子**序列或者转录起始位点。DNA甲基化转移酶可以催化CpG的甲基化反应。DNA甲基化转移酶有两种，Dnmt1是一种持续性甲基化转移酶，作用于只有一条链甲基化的DNA双链，使其完全甲基化，参与DNA复制过程中新合成链的甲基化修饰；Dnmt3a/Dnmt3b是一种从头甲基化转移酶，可以在CpG上产生新的甲基化修饰，首先半甲基化，继而全甲基化，该甲基化转移酶可能参与细胞生长分化的调控，在**基因甲基化中起到重要作用。近年来CRISPR/Cas9技术得到快速发展，在基因切割活性失活的dCas9的5’端融合一个Dnmt3a，能够通过dCas9介导特定位点的甲基化修饰，调控相关基因的表达。 DNA甲基化作为表观遗传学研究的重要范畴。

    cfDNABS-Seq送样要求一、送样类型分离好的血浆二、保存方式分离后的血浆，用ml离心管分装，例如：1ml/管；放-20℃冰箱中保存（短暂保存，1-2周）；放-80℃冰箱中长期保存(1年以内)；保存期间不能冻融。三、运输条件干冰运输：顺丰陆运（3-4天时间），夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰。四、抽血要求1、使用Streck采血管（不建议使用普通的EDTA-钠抗凝管），采集10ml外周静脉血（客户没有Streck采血管，公司配送）；2、室温或者放置4℃冰箱中半小时以上，不超过8小时，进行血浆分离步骤。五、血浆分离步骤1、4℃条件下以1600g离心10min，离心后将上清（血浆）分装到2、4℃条件下以16000g离心10min去除残余细胞，将上清移入新的离心管中，每管分装1ml;3、血浆样本存放于-80℃冰箱中保存;使用干冰运输,提取之前不能冻融。备注1：血浆分离在4℃条件进行，如果客户没有冷冻离心机，也可以在室温条件下进行；备注2：离心后取血浆上清，避免吸取白细胞；通常10ml全血可以获得4-5ml血浆。 高通量BSP测序结果多种展示形式。江苏6mA技术服务怎么样

筛选耐药的相关biomaker及表观调控机制。hMeDIP-Seq技术服务方案

血清甲基化用于乳腺*转移早期筛查

Methylation patterns in serum

DNA for early identification of disseminated breast cancer. Genome

Med. 2017;22;9(1):115. (IF=

8.898)

本课题通过RRBS甲基化测序筛选组织(n=31)样本, 确定了18个乳腺*特异性甲基化位点，选择其中6个位点在大样本量血清样本(n=110)中得到进一步验证; 并通过更大量血清样本(n=1344), **终筛选出血清EFC#93甲基化位点为早期诊断和***转移性乳腺*Biomarker。 hMeDIP-Seq技术服务方案