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液滴数字PCR源于乳液PCR( emulsion PCR) 技术，即将DNA模板与连接引物的磁性微球以极低的浓度(比如单拷贝) 包裹于油水两相形成的纳升至皮升级液滴中进行 PCR 扩增，扩增后的产物富集在磁性微球上，收集破乳后进行测序。通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的 PCR 反应体系，比微孔板和 IFC 系统更容易实现小体积和高通量，而且系统简单，成本低，因此成为理想的数字PCR技术平台。Vogelstein 及其同事提出的 BEAMing 技术就是一种基于乳液PCR的数字PCR系统。Lu 等也采用 BEAMing 和连接酶反应实现对 mRNA 的定量分析。Zhou 等在 BEAMing PCR 扩增后破乳，将连接不同产物的磁珠包被在聚丙烯酰胺凝胶中制成磁珠阵列进行荧光检测。可以用来检测外泌体micRNA。准确数字PCR专业服务

数字PCR技术的原理非常简单，然而在样品分散（divide）的环节上却遇到了无法突破的瓶颈。早期的dPCR尝试使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作为分散反应的载体，或者采用类似流式技术的磁珠乳液扩增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了***台商品化的基于芯片的商品化数字PCR系统。2008年德国 Inostics 推出基于磁珠法乳浊液扩增和流式检测方式的BEAMing dPCR 检测服务，但这些方法无论在分散程度和数据群体的体量上都无法达到更加精细的要求，时间和耗材成本严重限制了dPCR技术的发展。准确数字PCR专业服务数字PCR技术为基因表达分析提供了高精确的定量分析方法。

cdPCR主要以Fluidigm公司的BioMark HD系统以及Life Technology公司的QuantStudio 3D系统为**。Bio Mark系统采用微泵阀式芯片，以聚二甲基硅氧烷为芯片材料，主要依靠微流控通道与阀门的开闭进行原始体系分割，在芯片的反应仓进行PCR反应，然后通过类似于基因芯片的方法扫描每个通孔的荧光信号，进行目的序列含量的计算。QuantStudio 3D系统采用阵列微池式芯片，反应液由进样孔直接进入各微反应池。芯片式dPCR生成微滴体积均一，具有较高的稳定性，体系之间影响较小，但技术操作复杂，通量有限且实验成本较高。

微小残留病变（minimalresidualdisease，MRD）：随着化疗、靶向***、造血干细胞移植等***方式的改进，血液**的***效果日益改善。微小残留病（MRD）导致的复发是目前血液*****的一大难题。动态监测MRD对于评价***疗效、预测疾病复发、实施个体化***具有重要的指导意义。MRD检测方法需满足可定量、标准化、便捷性的要求。目前**常见的是流式细胞学（flowcytometry,FCM）和PCR两大类,但只有灵敏度高于10-4才能被纳入标准化评估。数字PCR技术，其有限稀释的特点可降低复杂的背景干扰，浓缩低丰度目的基因信号，从而提高MRD检测的灵敏度。在慢性髓系白血病中，Wang等同时用dPCR和qPCR检测了61名CML患者的外周血，这些患者在每3个月一次连续3次的qPCR检测中，已经检测不到BCR-ABL，dPCR检测到18%的患者是阳性的。在随后的随访中，dPCR能比qPCR提前几个月检测到BCR-ABL的升高。在淋系白血病的BCL2-IGHMBR检测中，Drandi等在222例样本中验证了dPCR和qPCR方法的一致性，还成功地将dPCR应用于3例qPCR无法检测的病例。数字PCR作为目前灵敏度和准确性比较高的分子检测方法，非常适用于微小残留病变评估。一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应。

为确保实验顺利进行，QIAcuity EG PCR Kit和Probe PCR Kit均采用**抗体修饰的热启动DNA聚合酶，利用小分子锁扣 (Guard molecular) 将DNA聚合酶与抗体紧密结合形成双保险，使其室温条件下失活，只有通过95℃高温2分钟才能开启小分子锁扣，***DNA聚合酶活性，有效避免了非特异性扩增现象。微反应单元体积大小一致且稳定是泊松分布准确计算的前提。样本反应液在进行液滴分散过程中由于液体表面张力、操作不当等影响，导致其部分发生融合和破裂。融合使液滴体积变大，破裂则导致有效分区数量变少更增加了交叉污染的风险。因此，整个实验过程需严格按照标准流程进行实验操作。相较于液滴式分区，QIAcuity数字PCR搭配的Nanoplate采用**纳米微孔设计，利用微流体技术将数字PCR反应体系分配到大小均一且固定微孔中，并在分区完成后自动封闭所有微孔联通管道，真正意义上实现**均一的微反应体系。在gDNA长度≥20kb或进行拷贝数变异检测实验时，必须对样品进行酶切处理。山东高灵敏度数字PCR专业服务

对模板量要求高，过多会导致无法定量，过少会导致信号过低。准确数字PCR专业服务

肺*的EGFR突变检测：EGFR突变目前已成为非小细胞肺*（Non-Small-Cell Lung Cancer，NSCLC）患者常规的伴随诊断，对于EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的使用具有重要的指导作用。然而，由于多数NSCLC都处于晚期，很难取到足够的**组织完成该检测，不方便对患者的疗效和耐药情况进行动态监测。相反，血液、胸水以及脑脊液之类的体液标本中会含有**来源的DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA），它们更容易获取，被认为是组织标本的有效替代品。由于体液标本中ctDNA的含量非常低，因此对检测方法提出了很高的要求。近年来，有研究者证实，数字PCR的检测敏感性可以低至0.04%，EGFR突变的血浆检测与组织学检测能够有很好的吻合性，相比于传统的检测方法，数字PCR可以***提高血浆中EGFR突变的检出率。此外，利用数字PCR***定量的优势，可以对血浆中EGFR突变的丰度进行动态监测，这种动态变化与患者使用TKI的疗效密切相关，可以更好的指导患者的***。随着越来越多循证医学证据的出现，NSCLC的血液EGFR突变检测正在成为ddPCR相当有前景的应用方向。准确数字PCR专业服务