天津荧光信号数字PCR方案

20 世纪末，Vogelstein等提出数字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板) ，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。与 qPCR 不同的是，数字PCR不依赖于CT值，因此不受扩增效率影响，扩增结束后通过直接计数或泊松分布公式来计算每个反应单元的平均浓度(含量)，能够将误差控制在5%以内，数字PCR 可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现***定量分析。可以用来检测外泌体micRNA。天津荧光信号数字PCR方案

从上世纪90年代以来qPCR技术的爆发式发展使得现代核酸检测技术具有全新的面貌，而进入二十一世纪之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA测序技术正在迅速发展，也是目前竞争**为激烈的研究领域之一，即使在这种情况下，dPCR技术仍然以其高度的灵敏性和特异性在诸多科学领域争取到属于自己的一席之地。即使在一些传统的qPCR应用领域，也有一些实验室同时选择dPCR平台进行平行实验以保证实验结果的准确和可重复性。在基因组变异研究领域，群体基因组水平上的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）检测面临的问题主要是突变序列往往与大量正常序列同时存在，竞争性反应严重影响突变序列的检测精度，数字PCR技术带来的极高的扩增特异性在稀有突变检测方面具有天然的优势，在**标志物检测、无创产前检查、线粒体突变检测等研究方向上，我们已经看到dPCR的许多精彩表现。天津核酸拷贝数定量数字PCR售后服务高精确度、高灵敏度，荧光定量qPCR灵敏度为1%-0.1%，数字化PCR灵敏度可达0.01-0.001%。

传统 PCR 或定量 PCR 反应都是在96/384孔板中进行的，因此早期的数字PCR技术也采用 96 /384孔板作为反应单元。但是数字PCR技术的灵敏度取决于反应单元的总数n，因此，理论上反应单元数越多越有利于提高灵敏度和准确度，普通的96 /384孔板无法满足检测的需要。而且，在96 /384 孔板中进行的PCR反应体系通常大于5μl，由试剂消耗引起的高成本问题令人望而却步。针对上述问题， Morrison 等在25mm×75mm不锈钢芯片上刻蚀了3072个直径为300μm的微反应室(如图2a所示)，每个反应单元的体积降低至33 nl。该芯片可在商品化 PCR 仪上使用，与384 孔板的检测灵敏度相当，但反应体积降低为原来的1/64，样品通量提高了24倍。随着反应单元数目的成倍增加，反应体积从微升级降至纳升级，传统的操作人员采用移液器加试样的方式已经无法满足快速精细取样的要求，因此需要借助高通量自动点样仪或机械手等设备，这无疑大幅提高了系统的成本和操作的复杂性。

虽然数字PCR的优势与临床应用前景已在许多研究中得到确认，但想要进一步在临床广泛应用，数字PCR需要针对以下几个方面进行升级：商用数字PCR系统需要进一步提升样本检测通量以充分满足COVID-19普筛的需求；需要制定国家或行业统一标准；需要产业界进一步降低设备成本；基于数字PCR的**检测试剂盒需要经过严格多中心评价，并获得NMPA、FDA、CE等监管机构的认证。随着科研和产业的持续研发和投入，未来数字PCR将在实验室或医院得到更多的应用，用于解决科研和临床问题，提供更准确的诊断结果。数字PCR有望成为下一代分子诊断的**技术。可以用来验证二代测序(NGS)。

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的***定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时*判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响**降低，对PCR反应抑制物的耐受能力**提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。对干扰分子（背景信号、PCR抑制剂等）耐受度高，通过信号的“有”“无”定量而不是Ct值。云南准确数字PCR共同合作

影响引物探针特异性的因素有很多种，譬如纯化方式、设计方法以及引物探针的修饰技术等。天津荧光信号数字PCR方案

*****的实时监控：已有数篇文章报道了使用数字PCR技术对患者***过程中的循环**DNA（ctDNA）进行检测，实时监控疾病进展。在非小细胞肺*、乳腺*和肠*等多种**患者中都取得了令人鼓舞的结果。与影像学及其他常规指标相比，ctDNA突变及丰度改变通常会提前数月出现，这样就可以提醒医生及时调整***方案，使患者得到更有效的***。无创产前筛查：唐氏综合征、地中海贫血或胎儿遗传性耳聋基因检测等，目前无创检测标本来源主要为孕妇血液，检测胎儿DNA会受到母体DNA的干扰，依靠数字PCR可提高检测准确性。对比NGS，数字PCR技术可以提高工作效率、降低检测成本。天津荧光信号数字PCR方案