广东数字PCR经验丰富

微小残留病变（minimalresidualdisease，MRD）：随着化疗、靶向***、造血干细胞移植等***方式的改进，血液**的***效果日益改善。微小残留病（MRD）导致的复发是目前血液*****的一大难题。动态监测MRD对于评价***疗效、预测疾病复发、实施个体化***具有重要的指导意义。MRD检测方法需满足可定量、标准化、便捷性的要求。目前**常见的是流式细胞学（flowcytometry,FCM）和PCR两大类,但只有灵敏度高于10-4才能被纳入标准化评估。数字PCR技术，其有限稀释的特点可降低复杂的背景干扰，浓缩低丰度目的基因信号，从而提高MRD检测的灵敏度。在慢性髓系白血病中，Wang等同时用dPCR和qPCR检测了61名CML患者的外周血，这些患者在每3个月一次连续3次的qPCR检测中，已经检测不到BCR-ABL，dPCR检测到18%的患者是阳性的。在随后的随访中，dPCR能比qPCR提前几个月检测到BCR-ABL的升高。在淋系白血病的BCL2-IGHMBR检测中，Drandi等在222例样本中验证了dPCR和qPCR方法的一致性，还成功地将dPCR应用于3例qPCR无法检测的病例。数字PCR作为目前灵敏度和准确性比较高的分子检测方法，非常适用于微小残留病变评估。在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。广东数字PCR经验丰富

数字PCR采用的策略概括起来非常简单，就是“分而治之”（divide and conquer），这种做法非常类似于计算机科学中的“分治算法”，将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA模板) ，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数。在实际的数字PCR实验中，事实上是通过呈现两种信号类型的反应器比例和数目进行统计学分析，计算出原始样本中的模板拷贝数。云南PCR数字PCR服务提高检测速度，进一步降低检测时间。

近几年来，随着纳米制造技术和微流体技术（nanofabrication and microfluidics）的发展，数字PCR技术遇到了突破技术瓶颈的比较好契机。1997年Kalinina, 、Brown J, 和Silver J使用纳升级芯片进行单克隆模板PCR扩增，获得了美国专利，更重要的是这种采用“电浸润法”进行纳升级芯片制造技术显露雏形。伴随二代测序技术发展起来的“油包水PCR”技术，可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴，可以作为dPCR的样品分散载体。

使用不合适的引物可能会引入引物二聚体、非特异性扩增等，进而影响实验结果的准确性。在此，小Q建议您在设计引物时需做以下几个方面的检查，***需对设计好的引物进行BLAST比对分析，以确保引物的特异性！在数字PCR***定量实验中，对于基因突变检测、基因表达差异分析和拷贝数变异鉴定等对实验精细性要求较高的实验，需要特异性更高的Assay。QIAGEN基于QIAcuity数字PCR平台开发并验证了针对上述常见应用的700多组dPCR LNA Assay，所有Assay均经过锁核酸修饰来增强其对互补序列的亲和力和特异性，进而提高实验结果的准确性。DNA聚合酶对实验的准确性起着至关重要的作用。

数字PCR技术的原理非常简单，然而在样品分散（divide）的环节上却遇到了无法突破的瓶颈。早期的dPCR尝试使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作为分散反应的载体，或者采用类似流式技术的磁珠乳液扩增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了***台商品化的基于芯片的商品化数字PCR系统。2008年德国 Inostics 推出基于磁珠法乳浊液扩增和流式检测方式的BEAMing dPCR 检测服务，但这些方法无论在分散程度和数据群体的体量上都无法达到更加精细的要求，时间和耗材成本严重限制了dPCR技术的发展。影响引物探针特异性的因素有很多种，譬如纯化方式、设计方法以及引物探针的修饰技术等。江苏荧光信号数字PCR口碑推荐

常见的300种人、小鼠和大鼠基因表达Assay均已在QIAcuity数字PCR平台上经过验证。广东数字PCR经验丰富

传统 PCR 或定量 PCR 反应都是在96/384孔板中进行的，因此早期的数字PCR技术也采用 96 /384孔板作为反应单元。但是数字PCR技术的灵敏度取决于反应单元的总数n，因此，理论上反应单元数越多越有利于提高灵敏度和准确度，普通的96 /384孔板无法满足检测的需要。而且，在96 /384 孔板中进行的PCR反应体系通常大于5μl，由试剂消耗引起的高成本问题令人望而却步。针对上述问题， Morrison 等在25mm×75mm不锈钢芯片上刻蚀了3072个直径为300μm的微反应室(如图2a所示)，每个反应单元的体积降低至33 nl。该芯片可在商品化 PCR 仪上使用，与384 孔板的检测灵敏度相当，但反应体积降低为原来的1/64，样品通量提高了24倍。随着反应单元数目的成倍增加，反应体积从微升级降至纳升级，传统的操作人员采用移液器加试样的方式已经无法满足快速精细取样的要求，因此需要借助高通量自动点样仪或机械手等设备，这无疑大幅提高了系统的成本和操作的复杂性。广东数字PCR经验丰富