浙江焦磷酸测序技术服务

    DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶(Dnmt)的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5-胞嘧啶的过程，刚被发现时被定义为第五种碱基，实际上它是一种重要的表观遗传学标记，在调控基因表达、维持染色质结构、基因印记、X染色体失活以及胚胎发育等生物学过程中发挥着重大的作用，它就像魔术师手中一顶**神奇的“帽子”，带给世人层出不穷的惊喜。DNA甲基化的发生、保持和去除都处在生物体精细的调控中，一旦发生紊乱，对于动物而言将导致胚胎死亡或者**等重大疾病，对于植物而言将会出现各种的表型缺陷，那么这顶神奇的“帽子”是如何发挥它神奇功用的呢？这个问题成为整个生物界**热的研究焦点之一。研究者们从DNA甲基化的发生机制，保持机制到去甲基化机制，从基因组甲基化状况研究到特异位点甲基化状况研究，从**初CpG位点的研究到non-CpG位点的研究，从高甲基化研究到低甲基化、未甲基化研究，以及与其密切相关的羟甲基化也慢慢进入人们的视野，***多角度解析DNA甲基化。在Nature、Science、Cell等**杂志上经常能看到它熟悉的身影，说它是生物学研究的“宠儿”一点都不为过。正所谓“工欲善其事，必先利其器”。 焦磷酸测序能提供杂合子缺失及细菌和病毒分型等技术服务。浙江焦磷酸测序技术服务

industryTemplate北京MeDIP-Seq技术服务共同合作RRBS用于人、哺乳动物及鱼类方向的高水平甲基化研究。

    甲基化-焦磷酸测序（升级版）之前的仪器是Q96，也就是说同时可以上96个反应，但是有效读长只有50bp左右（50bp之后开始衰减，后面的序列只能作为参考）；升级版的Q48，也就是48孔，每次上48个反应，但有效长度可以到100bp左右，而且之前很多不能测过去的特殊结构，现在大部分也能测了。甲基化--------焦磷酸测序的优势。样品要求·样品类型细胞、新鲜组织或DNA样品·样品量细胞样品请提供至少1×106个细胞，组织样品请提供至少100mg的组织块或切片，DNA样品请提供1μg以上的DNA·样品质量基因组DNA无明显降解，主带清晰，大于23Kb，无明显弥散。OD260/280值在～，浓度≥50ng/μl·样品保存细胞样品或新鲜组织块（切成～50mg的小块）可液氮冻存后，-80℃保存。DNA样品可溶于乙醇或超纯水中，-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融·样品运输样品置于ml冻存管中，封口膜封好。

    将待测DNA经过亚硫酸盐处理，通过PCR扩增过程引入T7启动子序列，经T7DNA聚合酶的体外转录过程得到各样本RNA产物，经碱基特异性酶切处理，得到RNA小片段，并用飞行质谱检测每个片段的分子量，***EpiTYPER程序完成数据的自动化处理并报告每个检测片段的甲基化程度。技术优势·检测片段长：扩增片段长度可达500bp·高灵敏度：可发现低至5%甲基化水平，样本起始量低至10ng。·重复性好：变异系数CV≤5%。·高性价比：用384孔板进行PCR反应，一个扩增产物可以进行多重CpG位点分析，无需后续验证，可直接用于文章发表。服务内容1.根据客户提供的序列信息进行预评估；2.进行样本DNA的分离、纯化、质检及亚硫酸盐修饰。3.使用特殊设计的一对引物扩增样本，得到带有T7RNA聚合酶启动子序列的扩增产物。4.在体外转录体系中，利用T7RNA聚合酶，将扩增产物转录为RN**断。5.利用RNaseA能够特异性识别并切割RNA中U3’端的特性，将RN**断切割成携带有CpG位点的小片断。6.使用sequenom®MassArray飞行质谱分析系统检测产物。由于同一片断中，只有CpG和CpA之间16Da的分子量差别，即质谱图中两者峰的差距。 FFPE样本只需要室温运输。

联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法（COBRA）

这种方法是将亚硫酸氢盐处理与酶切相结合来进行甲基化检测。DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶（BstUI）消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则 PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割；若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可计算出原样本中甲基化的比例。

这种方法**的优点就是相对简单，可进行快速定量，且需要的样本量少。然而，它的局限性也十分明显，只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，且阴性结果并不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。 通过甲基化数据，筛选疾病耐药的差异甲基化。浙江焦磷酸测序技术服务

N6-甲基脱氧腺苷是原核生物和真核生物的DNA修饰类型之一。浙江焦磷酸测序技术服务

    羟甲基化DNA免疫沉淀测序（HydroxymethylatedDNAImmunoprecipitationSequencing，hMeDIP-Seq）是通过5hmC特异性抗体富集羟甲基化的DN**段，然后结合高通量测序技术在全基因组水平上以较小的数据量，快速、高效地寻找羟甲基化区域。可广泛应用于羟甲基化与疾病关系研究以及羟甲基化在胚胎发育过程中的研究。技术优势从项目背景了解、协助方案设计、实验材料选取、建库测序，到数据分析每个项目有特定的科学问题；需要专业、有价值的建议；科学、缜密的设计及时高效的沟通；以保障高质量研究成果样本要求：基因组DNA:>=3ug；样品浓度>50ng/ul；无RNA和蛋白污染建库测序：测序策略：IlluminaHiSeq,PE150;测序深度：20-30Mreads信息分析基于全基因组范围的羟甲基化分析，数据质控，Peak锋Calling，Peak锋在基因组、染色体、功能元件上的分布，多样本羟甲基化差异聚类，差异羟甲基化DMR鉴定及相关基因的功能分析，结合项目背景和科学问题的数据亮点挖掘。 浙江焦磷酸测序技术服务