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    Agilent平台因为MeDIP技术本身的特点，都不能到达单碱基的分辨率，而Illumina的Infinium和GoldenGate检测技术却做得到。Illumina的Infinium甲基化检测技术来源与前期的SNP检测，采用的是单碱基延伸的原理。分析利用两个位点特异的探针检测这些序列差异的位点，一个探针是为甲基化位点(M磁珠类型)设计的，而另一个是为未甲基化位点(U磁珠类型)设计的。探针的单碱基延伸掺入了一个标记的ddNTP，它随后被荧光试剂染色。通过计算甲基化与未甲基化位点的荧光信号比例，可确定检测位点的甲基化水平。Illumina公司早期推出的InfiniumHumanMethylation27BeadChip芯片覆盖27,578个CpG位点。这款芯片在医学领域有***的应用，除了和**相关的甲基化筛选之外，也能用于其他疾病相关甲基化检测。因此对这款产品，研究者给予了很高的评价，目前此产品已停产，取而代之的是InfiniumHumanMethylation450BeadChip芯片。它以单碱基分辨率覆盖了基因组中超过45万个甲基化位点，实现了基因区域和CpG岛的***覆盖。此外，还包括CpG岛之外的CpG位点，在人类干细胞中鉴定出的非CpG甲基化位点，以及**和正常组织中差异表达的甲基化位点等等。它的高覆盖度、高通量以及低价格。 在哺乳动物中CpG以两种形式存在。浙江RIP-seq技术服务服务

DNA甲基化异常用于甲状腺结节诊断

Identification of

Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics. Clin

Cancer Res. 2019;15;25(2):544-551 (IF=

10.199)

恶性结节和良性结节常常难以诊断。本课题通过RRBS检测了109个甲状腺组织的DNA甲基化，发现*旁、良性结节和*组织之间存在***差异，并在65个甲状腺结节的回顾性队列样本中得到验证。这些组织特异性DMR与活性增强子和**相关基因密切相关，表明DNA甲基化为甲状腺结节提供准确的诊断。 广东hMeDIP-Seq技术服务经验丰富甲基化验证是甲基化研究必不可少的一环。

    甲基化是表观修饰的重要部分，DNA甲基化可以引起DNA构象、稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而影响基因表达。DNA链中含有很多CpG结构，双链DNACpG中的胞嘧啶五位碳原子通常容易被甲基化，基因组中60~90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇出现在基因启动子**序列或者转录起始位点。DNA甲基化转移酶可以催化CpG的甲基化反应。DNA甲基化转移酶有两种，Dnmt1是一种持续性甲基化转移酶，作用于只有一条链甲基化的DNA双链，使其完全甲基化，参与DNA复制过程中新合成链的甲基化修饰；Dnmt3a/Dnmt3b是一种从头甲基化转移酶，可以在CpG上产生新的甲基化修饰，首先半甲基化，继而全甲基化，该甲基化转移酶可能参与细胞生长分化的调控，在**基因甲基化中起到重要作用。近年来CRISPR/Cas9技术得到快速发展，在基因切割活性失活的dCas9的5’端融合一个Dnmt3a，能够通过dCas9介导特定位点的甲基化修饰，调控相关基因的表达。

亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)

这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，设计引物进行PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行克隆测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但因为涉及到测序，其结果准确但要求克隆时所挑克隆较多，操作繁琐，不易大批量操作。另外，甲基化程度的定量依赖于挑选克隆的数目，因此这种方法只能算得上是一种半定量的技术方法。

目前一般会先用BSP找到甲基化位点，然后根据甲基化位点设计MSP引物，进行相应PCR条件摸索，以用于大量样本的筛选。 筛选耐药的相关biomaker及表观调控机制。

    Agilent甲基化芯片通过SurePrint芯片合成**技术，结合优化的探针设计及实验方法，可灵活进行甲基化研究，得到高灵敏度、高特异性、高重复性的结果。技术流程：1.将基因组DNA超声打断成400-500bpDN**段；2.加热变性并将变性后的单链DNA样品分成两份；3.其中一份单链DNA样品加入抗5'-甲基化胞嘧啶核苷抗体。使用免疫磁珠法分离样品中甲基化DN**段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化DN**段被洗脱；4.纯化免疫共沉淀的DN**段；对MeDIP(Cy5)与Input(Cy3)样品分别进行标记；5.标记后的MeDIP与Input样品混合、变性，与芯片杂交；6.检测杂交信号并进行数据分析。芯片种类：Agilent**甲基化芯片，8x60K●和合作伙伴在Agilent公司定制的Promoter芯片。●绝大多数基因是针对基因启动子区域的CpG岛设计探针。●芯片上一共有4160个功能注释比较明确的基因，其中2128个和**发生有关系。●从功能上分，有256基因和细胞凋亡有关，1273个基因和信号传导有关，487个基因和压力和衰老有关。●特别适用于**甲基化研究。 焦磷酸测序能提供杂合子缺失及细菌和病毒分型等技术服务。陕西hMeDIP-Seq技术服务活动

850K芯片为半金标准，价格低，分析简单，较为适合EWAS类型的课题。浙江RIP-seq技术服务服务

微生物定植对肠道免疫和代谢相关基因DNA甲基化的影响——团队成员发表

Early microbial colonization

affects DNA methylation of genes related to intestinal immunity and metabolism

in preterm pigs. DNA Res. 2018 Jan 19. (IF= 5.415)

我们以早产幼猪为模型，采用RRBS测序，比较正常(CON,

n=7) 和口服*** (AB, n=7)早产猪的肠道DNA甲基化差异，发现***减少了细菌密度及多样性，同时改变了DNA甲基化水平。其中与先天免疫应答、吞噬、内皮稳态和组织代谢等相关基因的DNA甲基化和表达存在***的差异。这种有赖肠道菌群的表观遗传修饰参与调控肠道免疫及营养代谢等，可能对早产儿的短期和长期的肠道健康至关重要。 浙江RIP-seq技术服务服务